Florey, Güney Avustralya'nın Adelaide kentinde bir okul müdürünün oğlu olarak dünyaya geldi. Adelaide'deki St Peter's College ve Adelaide Üniversitesi'ne gitti ve burada 1921'de Lisans Diploması ve 1924'te Tıp Doktoru derecesiyle mezun oldu.
Florey, tıp diplomasını tamamladıktan sonra Melbourne'daki Walter ve Eliza Hall Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nde çalıştı ve burada Ernst Chain ile tanıştı. 1928'de Oxford Üniversitesi Sir William Dunn Patoloji Okulu'na taşındılar ve burada penisilinin geliştirilmesi üzerinde çalışmaya başladılar.
Penisilin 1928 yılında Alexander Fleming tarafından keşfedilmiş ancak kullanılabilir bir ilaç haline getirilmemişti. Florey ve Chain, penisilinin aktif maddesini izole etmeyi ve hastalara enjekte edilebilecek şekilde saflaştırmayı başardılar. Ayrıca penisilinin seri üretimi için yöntemler geliştirdiler ve bu da II. Dünya Savaşı sırasında yaygın olarak kullanılmasını mümkün kıldı.
Florey ve Chain'in penisilin üzerindeki çalışması, İkinci Dünya Savaşı sırasında sayısız hayat kurtardı ve bulaşıcı hastalıkların tedavisinde devrim yarattı. Florey, 1945'te Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'ne layık görüldü ve 1944'te şövalye unvanına layık görüldü.
Florey aynı zamanda seçkin bir yönetici ve eğitimciydi. 1959'dan 1962'ye kadar Oxford Üniversitesi'nde Rektör Yardımcısı olarak görev yaptı ve 1960'dan 1965'e kadar Londra Kraliyet Cemiyeti'nin Başkanıydı. Aynı zamanda Avustralya Bilim Akademisi ve Amerikan Sanat ve Bilim Akademisi'nin de üyesiydi. ve Ulusal Bilimler Akademisi.
Florey, 1968'de Oxford'da felç geçirerek öldü. 20. yüzyılın en önemli Avustralyalı bilim adamlarından biri olarak kabul ediliyor ve penisilin üzerine yaptığı çalışmalar milyonlarca hayat kurtardı.